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基因芯片原理和优势:
Affymetrix公司开发的寡聚核苷酸原位光刻专利技术,利用此技术用很少的步骤可合成大量的DNA阵列。 Affymetrix的原位合成技术可制作的点阵密度高达106~1010/cm2。
首先使固相片基羟基化,并用光敏保护基团将其保护起来,然后选取适当的避光膜(mask)使需要聚合的部位透光,其他部位不透光。这样,当光通过避光膜照射到支持物上时,受光部位的羟基就会发生脱保护而活化,从而可以反应结合碱基。由于参与合成的碱基单体一端可以进行固相合成,另一端受光敏基团的保护,所以原位合成后,可进行下一轮的光照、脱保护和固相合成。循环下去,不断改变避光膜的透光位点,就可以实现在同一玻片上合成成千上万种预定序列的寡核苷酸探针。
GeneChip独特的PM-MM探针设计
基因芯片杂交的灵敏度和特异性是芯片技术的核心,Affymetrix在探讨了各种各样的影响因素后,设计出了一种独特的PM-MM探针方案(见下图)。芯片上的每一个基因或EST都是由一个或几个探针组(probe set)组成,每组探针组又由11-20对25mer的探针对(probe pair)组成,每探针对包括两个探针池(probe cell),其中一个是完全匹配(Perfect-Match,PM)的,另外一个是序列中间有一个碱基错配的(Mis-match, MM)。
独特的PM-MM探针设计的优势
特异性好
灵敏度高
定量准确、重复性好
提供样品质控
特异性的提高
相比cDNA芯片和单一序列的寡核苷酸芯片,Affymetrix设计多个短的探针片段,可以有效的区分有同源性的基因序列,克服了背景噪声、错误和偏差,避免了同源性靶序列与探针交叉杂交,而引起的假阳性和判断错误。25mer长度的寡核苷酸的信号强度和分辨率达到了一个平衡,在这个长度下,有一个碱基发生错配,杂交复合物就会变得很不稳定。如果长度达到60mer,就无法区分序列上十分接近的序列了。此外, 从多个探针位点检测的荧光信号,经过综合评估、统计计算和分析,获得的数据比单个探针判断样品是否存在某一靶序列的数据更为可靠。
灵敏度的提高
在PM-MM探针设计中,MM探针是有效的内参照,它们与PM探针一样可以和非特异性序列结合,这样,就可以将不同来源的样品中的背景信号有效的定量扣除。这种独特的设计对于区分特异性和非特异性杂交是相当灵敏的。比较那些单一的基因探针来说,PM-MM探针的高特异性和灵敏度更适合检测低丰度表达的基因。如下图,仅用PM探针与联合应用PM-MM探针检测靶序列的灵敏度比较
如上图所示,将已克隆的转录产物以不同的浓度掺入到组织样品中,在组织样品中是不含有原始的克隆转录产物的。经过标记的样品与Affymetrix Genechip人类基因组芯片杂交,在克隆转录产物浓度低于8pM时,PM单独探针无法探测出相应的浓度变化,而与MM探针联合使用则可以探测出。PM-MM探针对的使用可以探测出的样品中转录物的范围为1:100,000-1:300,000。PM-MM探针对照设计可提高对复杂背景特异性检测,使得灵敏度与特异性之间达到一个优化的平衡。
定量准确、重复性好
Affymetrix的基因芯片好的重复性使得某一样品中基因表达的绝对水平是可靠的,还使得比较不同样品之间各种基因表达的相对比例是可靠的,而双色法需在每次杂交检测中设置对照,只能进行两个样品之间的比较,芯片之间的比较并不可靠。Affymetrix进行多个样品之间的比较时,只需在多个样本中设置对照即可。
两次制备的同一样本,不同批次的芯片
不同芯片间、不同批次样品间实验结果吻合极好,保证了多张芯片间的比较的有效、可靠性。 Ishii等比较了GeneChip技术和SAGE之后得出结论认为:用这两种方法检测获得的结果符合得很好,无论是用来进行绝对表达水平的检测还是比较样品之间的基因表达水平的检测。
Aach 等报告了他们试图努力将不同分析方法获得的数据进行整合和系统分析的工作,他们发现:Affymetrix 和SAGE检测获得的数据可直接用于mRNA相对表达水平的估计,而双色法得到的数据尚需进一步的讨论。
GeneChip严密的质控步骤
样品制备
芯片状况
系统运转
样品制备
在总RNA提取及cRNA制备好后,分别进行分光光度计的量检、变性胶电泳的质检探针组设计可以了解到基因各个部位的信号值情况,其中3’,5’信号值比值作为判断样品RNA的完整性的指标在芯片结果报告中将给出相关数据。
芯片状况
在杂交混合液中加入oligo B2 ,在芯片的扫描结果上如果可以清晰的看到四周、中心以及芯片名称的图样,证明芯片的各项常规参数正常。
通过芯片上的看家基因对芯片质量进行评定通过参入对照基因bioB,bioc,bioD and cre对芯片的灵敏度进行评定
系统运转
加入对照基因bioB,bioc,bioD and cre除了可以质控芯片的灵敏度外他们还是杂交、洗涤、扫描过程的质检标准。
另外仪器本身还规定有一定的噪音值背景值质控仪器的运转。
GeneChip种类齐全,应用广泛
Affymetrix公司具有强大的研发力量,目前提供世界上种类繁多、基因数目较多的各类基因芯片,有人、大鼠、小鼠、果蝇和拟南芥等多种模式生物的基因表达谱芯片,用于SNP研究的DNA 分析芯片及研究癌症和药物代谢的健康检测芯片等。
Affymetrix公司的基因芯片产品在世界范围内已广泛应用于人类疾病的分子机理、 肿瘤分型、药物筛选、免疫学、信号转导、基因调控、细胞周期与凋亡、药物代谢与毒理、神经发育与分化、SNP分析、细菌基因组研究以及植物基因调控等各个方向,并取得了巨大的成功。
(Utility Patent:US2004191807A1 产品详情请参考公司服务项目目录或电话400-885-1861咨询)
基因芯片服务项目和产品介绍:
上海邃志生物科技有限公司拥有Affymetrix公司4套新一代的芯片分析平台:GeneChip 3000 Target Genotyping System,配备有4通道扫描的Scanner 30007Gplus和可满足大规模基因组筛查的自动装片机,适合Affymetrix所推出的任何种类的芯片,可为您提供Affymetrix公司的 GeneChip系列产品包括:
⑴ 人全基因组表达谱芯片
⑵ 小鼠、大鼠等动物全基因组表达谱芯片
⑶ 水稻、拟南芥等植物表达谱芯片
⑷ 人SNP6.0分析芯片
⑸ 人Tilling全基因组扫描芯片
⑹ 外显子芯片
更多产品:
1.Human Expression Genome Arrays
Human Genome U133 Plus 2.0 Array
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Human Tiling Arrays
Human Promoter 1.0 Array?
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Mouse Genome 430 2.0 Array
Mouse Genome 430A 2.0 Array
Mouse Expression 430A Array
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Mouse Tiling Arrays
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3.Rat Expression Genome Arrays
Rat Genome 230 2.0 Array
Rat Exon 1.0 ST Array
Rat Gene 1.0 ST Array
4.Human DNA (SNP Genotyping) Analysis Arrays
Mapping 10K Xba 131 Array
Mapping 10K 2.0 Xba Array
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Mapping 250K Sty Array?
5.Other Arrays
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Arabidopsis Tiling 1.0R Array
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Canine Genome 2.0 Array
C. elegans Genome Array
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Citrus Genome Array
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Drosophila Genome 2.0 Array
Drosophila Genome Array?
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Zebrafish Genome Array